SMD1168 Chemically Competent Cell

SMD1168 Chemically Competent Cell

SMD1168菌株是invitrogen公司开发专门用于重组蛋白表达的毕赤酵母菌株。SMD1168是组氨酸缺陷型菌株，基因组中组氨酸脱氢酶（His4）基因位点产生突变，自身无法合成组氨酸；部分携带HIS筛选标记的毕赤酵母表达质粒（pPIC3.5K/pPIC9K/pAO815等）可以表达HIS4基因，与SMD1168互补，通过组氨酸缺陷培养基来筛选整合成功的阳性转化子；其他无HIS筛选标记的毕赤酵母表达质粒（pPICZ A, B, C，pPICZα A, B, C等）也可通过Zeocin或盐酸博来霉素筛选阳性转化子。SMD1168毕赤酵母的表型为Mut+, Pep4–, His–，His–表示SMD1168是组氨酸缺陷型菌株，不能在组氨酸缺陷型培养基中生长；Pep4–表示蛋白水解酶A缺陷，Pep4编码蛋白水解酶A，是液泡内的天冬氨酸蛋白酶，能够自激活，由于蛋白水解酶A可以促进其他蛋白水解酶的激活，所以pep4缺陷型菌株的蛋白水解酶B活力也下降了，这有助于目标蛋白的稳定表达；Mut+表示SMD1168含有有功能的AOX1基因（毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶：AOX1、AOX2，野生型毕赤酵母中大多数的醇氧化酶是 AOX1基因产物，甲醇可诱导 AOX1基因表达，AOX1蛋白产物最高可占细胞中可溶蛋白的30%以上，很多毕赤酵母表达质粒正是利用AOX1表达框进行外源基因表达的，若毕赤酵母含有有功能的AOX1基因就称为Mut+型；AOX2是AOX1的同源基因（97%的同源性），在缺失AOX1基因或AOX1基因丧失功能时，AOX2基因会发挥作用，产生一种表型为MutS的突变株，但AOX2基因氧化甲醇的能力比AOX1弱，结果是细胞代谢甲醇的能力下降，在甲醇培养基中生长缓慢。针对具体的蛋白，很难预测选择Mut+还是MutS作为宿主进行蛋白表达更好，虽然Mut+型酵母转录得到的mRNA更多，但并不一定可以产生有活力的蛋白质；MutS型酵母虽然生长缓慢，转录得到的mRNA比Mut+少，但有可能更有利于蛋白形成正确构象，产生有活力的蛋白质）。SMD1168化转感受态细胞经特殊工艺制作，线性化的pPIC9K质粒（9.3kb，Amp^R）检测转化效率>10⁴ cfu/μg DNA。

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