荧光素酶报告基因检测

服务介绍

荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称，来自于自然界能够发光的生物。目前，以北美萤火虫（Photinus pyralis）来源的荧光素酶基因应用的最为广泛。利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上/下游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，经适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。

启动子结构分析：

将启动子区域序列(通常2k左右)进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体中替换启动子序列，检测其启动子活性。特定转录因子和启动子互作分析。将该序列(通常为启动子区域)插入报告基因载体，同时在原生质体共转过表达该转录因子，可分析转录因子过表达是否提高或者降低萤光素酶活性。

转录因子与调控序列互作分析：

将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转其转录因子，可分析转录因子是否提高萤光素酶活性。

miRNA靶基因互作分析：

由于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用，可以将目的基因的3’UTR构建到报告基因luc的后面，通过比较过表达或者干扰miRNA后，报告基因表达的改变可以定量反应miRNA对目的基因的抑制作用；作用位点的点突变等方法可以进一步确定miRNA 于靶基因3’UTR的具体作用位点。

服务优势

▶灵敏度高，比Western blot灵敏度高1000倍以上；

▶可增设预实验检测启动子活性；

▶增加了阳性对照以确保实验流程的可靠性；

▶体内实验，更加真实反馈植物体内的互作情况。

服务流程

文案展示

(1) 转录因子与调控序列互作分析

Petal size is controlled by the MYB73/TPL/HDA19-miR159-CKX6 module regulating cytokinin catabolism in Rosa hybrida

期刊：nature communications

Repression of transactivation of the MIR159 promoter by RhMYB73. Left, diagrams of reporter and effectorconstructs. Middle images, brightfield and LUC activity. Right, quantitative analysis.Data are shown as means ± SD (n = 3). The experiments were performed independently twice with similar results, and one representative result is shown. Differentlowercase letters (in (d) and (e)) indicate significant differences according to oneway ANOVA with Tukey’s multiple comparisons test (P < 0.05). Asterisks (in (f))indicate statistically significant differences (two-sided Student’s t-test; **P < 0.01).

(2) miRNA 靶基因互作分析

Transcriptome and miRNAome analyses uncover the regulatory role of miR6155 in trichome development of tobacco

期刊：Chemical and Biological Technologies in Agriculture

Validation of miRNAs and their targets in vivo. A Heatmap of miRNA fold change between trichome and leaf-trichome samples with respect to indicated target genes. Log2fold changes are shown here. B–F The validation of interactions between five known and novel miRNAs and their targets. Above, the target site between miRNA and corresponding targets. Below, photographs of the co-infiltrated N. benthamiana leaves on the third day after infiltration under UV light. Top left, pGreenII 62-SK+pGreenII 0800-target; top right, pGreenII 62-SK-miRNA+pGreenII0800-target; negative Control, pGreenII 62-SK+pGreenII 0800-LUC; lower right, pGreenII 62-SK-miRNA+pGreenII 0800-LUC. B NAC021 with its target miR164, C AP2 with its target miR172, D MYB36 with its target miR6145, E WRKY6 with its target miR6155, and F TIFY10B with its target novelmiRNA-9.

适用领域

▶启动子结构分析，将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体，检测其启动子活性。

▶启动子SNP分析，一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。

▶验证特定转录因子同其调控序列的作用，将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达该转录因子，可分析转录因子过表达是否提高荧光素酶活性。

▶可以分析信号通路是否激活，将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，在不同上游信号条件下，荧光素酶活性代表了通路的下游响应。例如在GPCR研究中，将cAMP response element（CRE）载入报告基因载体，构建稳定表达细胞株后，可以用于分析GPRC的激活与抑制剂筛选。又如，将HIF1α的响应原件hypoxia-responsive element (HRE)插入luciferase报告载体构建稳转细胞株，可以用于低氧相关通路的研究。

▶验证microRNA的靶序列，将待测的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，如果荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列。